編譯：微科盟 痞老板，編輯：微科盟 景行、江舜堯。

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導(dǎo)讀

呼吸系統(tǒng)復(fù)雜的細(xì)胞異質(zhì)性給該領(lǐng)域的研究人員帶來了獨特的挑戰(zhàn)。盡管bulk RNA測序和單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）為呼吸系統(tǒng)中的細(xì)胞類型和異質(zhì)性提供了見解，但相關(guān)的特異性空間定位和細(xì)胞相互作用尚未明確闡明。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）填補了這一空白，并在呼吸研究中得到了廣泛應(yīng)用。本文綜述了近年來ST的最新迭代技術(shù)，總結(jié)了ST如何應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)的生理和病理過程，重點是肺部。最后，作者提出了當(dāng)前的挑戰(zhàn)和潛在的發(fā)展方向，包括高通量全長轉(zhuǎn)錄組、多組學(xué)整合、時空組學(xué)、生物信息學(xué)分析等。這些觀點有望推動包括呼吸系統(tǒng)研究在內(nèi)的系統(tǒng)機(jī)制研究。

論文ID

原名：Spatial transcriptomics: recent developments and insights in respiratory research

譯名：空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)：呼吸研究的最新進(jìn)展和見解

期刊：Military Medical Research

IF：21.1

發(fā)表時間：2023年8月

通訊作者：趙祥偉，王周光

通訊作者單位：東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院甌江實驗室

DOI號：10.1186/s40779-023-00471-x

主要內(nèi)容

1 前言

呼吸系統(tǒng)由呼吸道和肺部組成，是與外部環(huán)境直接接觸的器官之一。其結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性阻礙了人們對其生理和病理過程的理解。大多數(shù)常見呼吸道疾病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，是影響公眾健康的一個重大問題。肺癌是臨床上最常見的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率在所有類型的腫瘤中排名第一。肺部腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜景觀是導(dǎo)致其誤診的主要因素。慢性呼吸道疾病，如哮喘、肺氣腫和支氣管炎，目前仍然根據(jù)呼吸道癥狀、醫(yī)學(xué)成像和肺功能檢測來診斷，但它們具有高度的異質(zhì)性，并且經(jīng)常重疊。這種對潛在疾病機(jī)制的模糊描述導(dǎo)致了非特異性的治療方案，最終可能會減緩這些疾病的治療效果。此外，肺結(jié)核和肺炎給患者的家庭和社會帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，揭示呼吸道疾病的發(fā)病機(jī)制，尋找特定的生物標(biāo)志物和新的治療靶點是改進(jìn)現(xiàn)有診斷和治療的重要策略。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是結(jié)合高通量測序和生物信息學(xué)來探索生物學(xué)機(jī)制的重大進(jìn)步。然而，bulk測序分析掩蓋了單個細(xì)胞的表型和功能差異，無法確定單細(xì)胞分辨率的分子特征。隨著單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）的發(fā)展，越來越多的細(xì)胞類型和亞型被檢測和闡明，從而可以定義肺部的多種細(xì)胞類型和相關(guān)分子特征，為研究呼吸系統(tǒng)提供了有價值的工具。然而，由于單細(xì)胞測序中細(xì)胞解離導(dǎo)致的空間信息丟失，無法在肺部解剖中描述相鄰細(xì)胞的相互作用和功能變化。此外，細(xì)胞狀態(tài)和不同細(xì)胞位置之間的關(guān)系也應(yīng)該被清楚闡明。

自2016年提出以來，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）為破譯生理和病理基礎(chǔ)提供了一個新的視角。在保持原始空間背景的同時，定量轉(zhuǎn)錄組分析允許產(chǎn)生的基因表達(dá)特征與細(xì)胞空間定位、生理學(xué)和組織學(xué)相關(guān)聯(lián)。此外，ST研究可以揭示亞細(xì)胞RNA的分布模式，以幫助理解空間標(biāo)記和調(diào)節(jié)的生物學(xué)過程。隨著ST樣本采集和處理技術(shù)的發(fā)展，試劑和測序成本的同時降低，以及計算平臺的日益強大，解決基本生物學(xué)問題的潛力正在穩(wěn)步擴(kuò)大。對ST的一些相關(guān)應(yīng)用已經(jīng)被綜述。然而，與腦神經(jīng)科學(xué)、胚胎發(fā)育和心臟等器官組織相比，ST在呼吸和肺部疾病的研究中很少被回顧。

本文綜述了近年來最新的ST迭代技術(shù)，并總結(jié)了這些技術(shù)在肺發(fā)育、肺圖譜、肺癌和肺損傷等呼吸系統(tǒng)生理病理過程中的應(yīng)用。最后，提出了目前面臨的挑戰(zhàn)和潛在的發(fā)展方向，包括高通量全長轉(zhuǎn)錄組、多組學(xué)和時空組學(xué)整合、生物信息學(xué)分析等。本文將以全面的疾病覆蓋、深入的疾病機(jī)制探索、強調(diào)空間異質(zhì)性和未來發(fā)展方向為重點，為ST在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用領(lǐng)域做出獨特而有價值的貢獻(xiàn)。

2 ST的發(fā)展和局限性

空間轉(zhuǎn)錄組方法發(fā)展迅速，根據(jù)檢測策略可分為基于成像的方法和基于測序的方法。以前的綜述已經(jīng)詳細(xì)闡述了ST的原理和分類。本文主要關(guān)注這些技術(shù)的創(chuàng)新形式和變體。

2.1 基于成像的ST策略

基于圖像的ST技術(shù)包括基于熒光原位雜交（ISH）和基于原位測序（ISS）的方法。高分辨率顯微鏡和單分子熒光原位雜交（smFISH）技術(shù)的出現(xiàn)，使得原位亞細(xì)胞分辨率轉(zhuǎn)錄本的量化成為可能。一個獨特的熒光標(biāo)記探針結(jié)合RNA，允許單個分子的定位，該技術(shù)的變體RNAscope已商品化，并且多輪雜交、成像和探針解剖等策略已被廣泛應(yīng)用，如sequential FISH（seqFISH）（圖1a）?；诘葴財U(kuò)增的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）也已被應(yīng)用于解決高自發(fā)熒光的問題，即smHCR（圖1b）。為了克服探針雜交錯誤和讀取錯誤，已經(jīng)開發(fā)了一種條形碼分配方案，即多路錯誤魯棒FISH（MERFISH），并廣泛用于組織水平的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄定位和ST（圖1c）。在此基礎(chǔ)上，序列熒光原位雜交（seq-FISH ）、ouroboros smFISH（osmFISH）和交換反應(yīng)信號放大（SABER）被提出來解決成像過程中的分子擁擠問題。其中，seq-FISH 使用20個探針和3種激發(fā)光來分析10000個基因（圖1d）。增強型電FISH（EEL-FISH）結(jié)合了電泳輔助大組織RNA采樣和多重FISH，用于厚組織的轉(zhuǎn)錄成像，減少了數(shù)據(jù)收集時間。最近，擴(kuò)增FISH（exFISH）和擴(kuò)增輔助迭代熒光原位雜交（EASI-FISH）被用于使用水凝膠擴(kuò)增的組織中基因表達(dá)的三維（3D）分辨率。總的來說，由于雜交技術(shù)的昂貴和耗時以及額外的挑戰(zhàn)，如組織中的背景熒光，迄今為止，基于ISH的方法僅限于細(xì)胞和組織培養(yǎng)的研究。

圖1.基于成像的ST策略。a）seqFISH通過順序染色/成像循環(huán)在空間中解碼轉(zhuǎn)錄物。b）與seqFISH相比，smHCR可以實現(xiàn)約20倍信號放大，原位檢測單個信使核糖核酸。c）MERFISH使用組合FISH標(biāo)記和糾正錯誤的條形碼方案實現(xiàn)了數(shù)千個RNA成像。d）seqFISH ?在四輪條形碼中使用20個探針進(jìn)行原位RNA成像。e）通過連接測序的ISS方法（ISS，IISS）。f）Electro-seq將生物電子學(xué)與ISS相結(jié)合，實現(xiàn)電生理學(xué)和基因表達(dá)譜分析。g）非靶向測序，如FISSEQ和ExSeq，能夠?qū)φ麄€轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行無偏見的覆蓋測序。ST空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，F(xiàn)ISH熒光原位雜交，seqFISH ?序列FISH ，smHCR單分子雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，MERFISH多重錯誤穩(wěn)健FISH，原位雜交，ISS原位測序，IISS改進(jìn)原位測序，F(xiàn)ISSEQ熒光原位測序，Electro-seq原位電測序。

基于ISS的方法分為靶向和非靶向mRNA檢測。ISS是最早的靶向原位測序技術(shù)之一（圖1e），通過掛鎖探針和滾圈擴(kuò)增（RCA）產(chǎn)生信號，使256個RNA轉(zhuǎn)錄物能夠在單輪雜交中表達(dá)，并以Cartana的形式商業(yè)化。然后，BOLORAMIS（連接在擴(kuò)增的RNA上的條形碼寡核苷酸，用于多重和平行原位分析）通過引入DNA連接酶SplintR連接酶解決了ISS檢測效率低的問題?；陔s交的ISS（HybISS）允許條形碼系統(tǒng)改善原位檢測，并消除了ISS序列連接化學(xué)的局限性。BaristaSeq利用合成化學(xué)測序技術(shù)，通過多輪成像顯示更高的信噪比，并對RCA產(chǎn)物進(jìn)行特定檢測。在2023年的預(yù)印本研究中，Tang等人提出了改進(jìn)的ISS（IISS），利用2堿基編碼策略開發(fā)了一種改進(jìn)的組合探針錨定連接化學(xué)，用于條形碼查詢，提高了ISS的信號強度和特異性（圖1e）。此外，最近的一項研究將電化學(xué)和ISS（Electro-seq）結(jié)合起來，將細(xì)胞電生理與單細(xì)胞水平的基因表達(dá)聯(lián)系起來，并確定心肌細(xì)胞發(fā)育過程中基因表達(dá)譜的變化（圖1f）。

另一方面，空間分辨轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增子讀出圖譜（STARmap）無需cDNA合成，使用SNAIL探針和通過動態(tài)退火和連接（SEDAL）減少誤差的測序來識別基因標(biāo)識符。通過結(jié)合水凝膠組織化學(xué)，它分析3D組織中的組織樣本，而不是單個2D模式。今年，該團(tuán)隊進(jìn)一步更新了STARmap，即STARmap PLUS，并在阿爾茨海默病小鼠模型中實現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)的聯(lián)合檢測。

熒光原位測序（FISSEQ）是非靶向測序中的一種代表性方法，可以實現(xiàn)對整個轉(zhuǎn)錄組的無偏轉(zhuǎn)錄。然而，其隨機(jī)引物導(dǎo)致檢測效率低，并涉及復(fù)雜的酶促反應(yīng)（圖1g）。相關(guān)試劑和儀器已生產(chǎn)并商業(yè)化?；贔ISSEQ，非靶向擴(kuò)增測序（ExSeq）將擴(kuò)增顯微鏡與ISS相結(jié)合，使用擴(kuò)增的水凝膠錨定RNA并生成光學(xué)條形碼，并已用于果蠅胚胎和小鼠大腦的基因分析（圖1f）。

2.2 基于測序的ST策略

與基于成像的方法相比，結(jié)合下一代測序（NGS）平臺和空間信息顯著提高了ST的通量和轉(zhuǎn)錄物的無偏檢索。開發(fā)了一種基于激光捕獲顯微切割（LCM）和scRNA-seq的方法，以允許在顯微鏡下對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行空間無偏分析，并對感興趣區(qū)域（ROI）進(jìn)行分類和測序（圖2a）。此外，Tomo-seq、地理位置測序（Geo-seq）和proximID被開發(fā)用于檢測少量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的異質(zhì)性和空間差異。目前，光學(xué)標(biāo)記物已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的物理解剖學(xué)，如NICHE-seq、體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組分析（TIVA）、ZipSeq（圖2b），它們使用照明模式和光籠寡核苷酸來標(biāo)記ROI；GeoMx數(shù)字空間圖譜利用可切割的寡核苷酸標(biāo)簽來量化ROI中RNA或蛋白質(zhì)的豐度。一種名為Image-seq的技術(shù)允許使用具有高靈敏度和轉(zhuǎn)錄覆蓋率的活體顯微鏡采集位置特異性活細(xì)胞進(jìn)行測序，但缺點是降低產(chǎn)量（圖2c）。

圖2.基于測序的ST策略。a）LCM-seq集成LCM和scRNA-seq以實現(xiàn)區(qū)域測序。b）ZipSeq使用光激活標(biāo)簽來實現(xiàn)ROIs的標(biāo)記、分離和scRNA-seq。c）Image-seq允許采集特定位置的活細(xì)胞，以便通過活體顯微鏡進(jìn)行測序。d）Stereo-seq利用具有空間條形碼的DNA納米球進(jìn)行轉(zhuǎn)錄空間定位。e）sci-Space使用空間條形碼對組織切片中的細(xì)胞核進(jìn)行成像、標(biāo)記和轉(zhuǎn)錄組測序。f）基于illumina聚類和序列讀取的Seq-Scope和Pixel-Seq。g）DBiT-seq利用微流體通道進(jìn)行正交條形碼，類似的技術(shù)包括xDBiT、CBSST-seq和Matrix-seq。hSTRS使用10×Visium全轉(zhuǎn)錄組分析平臺。

鑒于成像和顯微切割技術(shù)的低通量和捕獲率問題，研究人員正在逐步考慮原位空間索引方法。研究人員開發(fā)了ST技術(shù)，利用空間條形碼和唯一分子標(biāo)識符（UMI）定位信使核糖核酸的位置信息和表達(dá)水平，并開發(fā)了10×Genomics（100μm），其捕獲效率（10×Visium，55μm）已得到進(jìn)一步改善。為了獲得更高的分辨率，已經(jīng)提出了利用隨機(jī)條形碼珠子的Slide-seq（10μm）和高分辨率ST（HDST，2μm）。Slide-seqV2（10μm）優(yōu)化了文庫構(gòu)建和陣列索引，并在近細(xì)胞分辨率下證明了ST測序的高捕獲效率。然而，低靈敏度和需要對珠子預(yù)解碼限制了它們的應(yīng)用。空間增強分辨率組學(xué)測序（Stereo-seq，0.22μm）使用以陣列模式沉積的隨機(jī)條形碼DNA納米球來獲得納米級分辨率。它已被應(yīng)用于構(gòu)建器官發(fā)生的時空轉(zhuǎn)錄圖譜（圖2d）。sci-Space（200μm）和XYZeq（將空間元數(shù)據(jù)條形碼到scRNA-seq庫中的工作流程）（500μm）在大尺度上分析細(xì)胞和核的空間坐標(biāo)。然而，它們不能提供實際的空間單細(xì)胞圖譜，因為它們失去了細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄信息（圖2e）。Seq-Scope（0.5-0.8μm）直接使用illumina NGS芯片生成空間條形碼陣列，實現(xiàn)空間條形碼的亞細(xì)胞分辨率，用于可視化細(xì)胞核（圖2f）。類似的illumina化學(xué)，多索引文庫測序（Pixel-seq，1μm），通過圖案條形碼凝膠的可重復(fù)酶復(fù)制，成本降低了35倍，與現(xiàn)有方法相比，分辨率提高了200倍（圖2f）。

基于微流體通道的方法也已集成并用于空間定位。用于空間組學(xué)測序的組織中的確定性條形碼（DBiT-seq）（10μm）可以通過交叉條形碼對組織進(jìn)行空間編碼，從而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)分析（圖2g）。受該方法的啟發(fā)，組織中的多重確定性條形碼（xDBiT）、用于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序的載玻片上的交叉擴(kuò)增條形碼（CBSST-seq）和Matrix-seq（一種基于微流體的條形碼策略）也已被開發(fā)和應(yīng)用，并擴(kuò)展到空間多組學(xué)（SM-omics），如基于微流體索引的空間ATAC和RNA測序（MISAR-seq）和轉(zhuǎn)錄組和表位的空間共索引（spatial-CITE-seq）。此外，空間總RNA測序（STRS）利用10×Visium平臺能夠檢測全譜RNA，而不僅僅是多腺苷酸化的RNA轉(zhuǎn)錄物（圖2h）。基于空間索引方法的ST面臨的一個更普遍的挑戰(zhàn)是如何平衡mRNA捕獲效率和橫向擴(kuò)散。此外，大規(guī)模的雜交逆轉(zhuǎn)錄可能導(dǎo)致基因表達(dá)的畸變。

3 ST在呼吸研究中的應(yīng)用

由于研究人員對呼吸系統(tǒng)分子結(jié)構(gòu)的極大興趣，ST已廣泛應(yīng)用于肺發(fā)育和呼吸系統(tǒng)疾病機(jī)制的研究。本節(jié)總結(jié)了呼吸系統(tǒng)的新興應(yīng)用，如肺發(fā)育、肺圖譜、肺癌和肺損傷（圖3）。

圖3.ST在呼吸系統(tǒng)研究中的應(yīng)用。ST用于構(gòu)建肺空間圖譜和識別細(xì)胞組成。在肺癌中，ST揭示了腫瘤微環(huán)境、異質(zhì)性、進(jìn)化和轉(zhuǎn)移以及腫瘤內(nèi)微生物群起源的進(jìn)一步定位。ST的其他應(yīng)用還包括肺發(fā)育中的基因表達(dá)模式、肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和COVID-19肺炎的發(fā)病機(jī)制。ST空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，COVID-19新型冠狀病毒肺炎，NK cell自然殺傷細(xì)胞。

3.1 肺發(fā)育

Ljungberg等人使用空間原位雜交試圖闡明出生前和出生后小鼠肺部的基因表達(dá)模式，以描述肺泡化關(guān)鍵階段肺部發(fā)育的細(xì)節(jié)，并改進(jìn)LungMap的數(shù)據(jù)。最近的一項研究應(yīng)用原位雜交分析來確定人肺中克隆性間充質(zhì)細(xì)胞的來源，特別是來自外膜成纖維細(xì)胞亞群的來源。間充質(zhì)細(xì)胞的空間異質(zhì)性及其潛在特征也已被描述。

3.2 肺的細(xì)胞組成和空間圖譜

人類細(xì)胞圖譜（HCA）旨在以單細(xì)胞分辨率建立健康個體不同器官和組織的圖譜數(shù)據(jù)，包括專注于呼吸系統(tǒng)的人類細(xì)胞肺圖譜（HCLA）。在呼吸系統(tǒng)研究中，細(xì)胞圖譜識別了以前未定義的細(xì)胞類型及其表型和相互作用，增強了人們對呼吸系統(tǒng)和肺部疾病的理解。結(jié)合scRNA-seq，許多研究已經(jīng)生成了健康和疾病的肺部分子細(xì)胞圖譜，如LungMAP、discovAIR等。研究人員使用基于液滴和平板的scRNA-seq定義了人類肺部58種不同的細(xì)胞類型和基因表達(dá)譜。然而，由于缺乏描述肺部解剖特征的極端細(xì)胞異質(zhì)性所需的空間背景和分辨率，這些數(shù)據(jù)是不準(zhǔn)確的。事實上，最近的一項研究使用ST來區(qū)分80種細(xì)胞類型和狀態(tài)，包括11個在以前的肺圖譜研究中沒有注釋的細(xì)胞群，并定義了腺體相關(guān)的免疫生態(tài)位。結(jié)合scRNA-seq的基因表達(dá)譜和完整組織切片上的空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)，Sountoulidis等人構(gòu)建了人類肺早期發(fā)育的全面位置圖，描述了導(dǎo)致肺細(xì)胞顯著異質(zhì)性的發(fā)育軌跡。人們認(rèn)為，肺在mRNA水平上的空間多樣性與蛋白質(zhì)組有關(guān)，此外還與生理功能有關(guān)。此外，已經(jīng)開發(fā)了幾種原位雜交技術(shù)，如鄰近連接原位雜交技術(shù)（PLISH）和SCRINSHOT，并用于鑒定和定位小鼠的肺和氣道細(xì)胞類型，包括最近發(fā)現(xiàn)的肺離子細(xì)胞。在遠(yuǎn)端氣道和肺泡中，15種標(biāo)記物被證明用于識別巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞，如AT1和AT2細(xì)胞、支氣管外分泌細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。

3.3 肺癌

在過去的幾個世紀(jì)里，腫瘤被認(rèn)為是一個高度組織化的“器官”，而不是異常增殖細(xì)胞的簡單聚集。癌癥是腫瘤疾病死亡的主要原因。醫(yī)學(xué)研究的一個重大挑戰(zhàn)是在肺部病變開始和發(fā)展時確定正常的細(xì)胞軌跡點，并分析治療后的細(xì)胞反應(yīng)。

3.3.1 肺癌微環(huán)境

免疫檢查點（ICP）靶向治療在癌癥中取得了相當(dāng)大的成功，包括非小細(xì)胞癌癥（NSCLC）、肺腺癌（LUAD）、鱗狀和非鱗狀癌。然而，研究表明，接受靶向藥物治療的患者的陽性反應(yīng)率仍然很低，可能存在眾多免疫相關(guān)不良事件。此外，原發(fā)性腫瘤對ICP靶向藥物的耐藥性往往阻礙了臨床發(fā)展。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境（TME）與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，在免疫逃避方面比ICPs更重要。因此，迫切需要提高對TME的認(rèn)識，更好地對患者進(jìn)行分類，并確定新的治療靶點，以改善預(yù)后。肺腫瘤中TME的不同細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組可以以單細(xì)胞分辨率檢出，其表型和協(xié)同行為已被描述。空間轉(zhuǎn)錄分析可以揭示基質(zhì)細(xì)胞在肺TME中的空間分布偏好。例如，在肺癌小鼠模型中，使用10×Chromium和原位成像來探索Tgfbr2缺失導(dǎo)致的TME重塑和促進(jìn)免疫排斥。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）是TME中最豐富的免疫細(xì)胞之一，是抗腫瘤免疫的重要調(diào)節(jié)因子。然而，調(diào)控它們在TME中的豐度的機(jī)制仍有待探索。Larroquette等人分析了接受ICP阻斷劑治療的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)處理腫瘤樣本，報告稱TAMs中腫瘤區(qū)室的富集與免疫療法耐藥性有關(guān)。使用NanoString GeoMx對來自16個腫瘤標(biāo)本的78個原位轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行空間分析。結(jié)果表明，TAMs在NSCLC中的預(yù)后作用與腫瘤細(xì)胞的距離直接相關(guān)，在TAM高水平浸潤的腫瘤中，CD27、CCL5和ITGAM三個顯著上調(diào)的基因可能是免疫治療的潛在靶點。此外，應(yīng)用多重免疫組織化學(xué)（mIHC）和數(shù)字空間分析器（DSP）對免疫檢查點抑制劑（ICI）治療后的非小細(xì)胞肺癌患者樣本進(jìn)行了TME分析。

3.3.2 肺癌異質(zhì)性

許多基于scRNA-seq的研究揭示了癌癥細(xì)胞的異質(zhì)性。隨著空間轉(zhuǎn)錄分析和scRNA-seq整合的進(jìn)展，研究人員將特定的分子表型與未知的細(xì)胞相互作用模式或臨床表現(xiàn)相結(jié)合，對腫瘤細(xì)胞亞群進(jìn)行分類。例如，Sinjab等人確定了從正常組織區(qū)域到LUAD的空間位置進(jìn)化的細(xì)胞譜系、狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄組特征，其中上皮細(xì)胞中CD24的顯著表達(dá)驅(qū)動了原發(fā)性腫瘤特征。他們的數(shù)據(jù)提供了LUAD的空間圖譜，以確定早期攔截的潛在目標(biāo)。張等人使用Visium平臺鑒定肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）中的空間位置特異性亞克隆。結(jié)果表明，腫瘤亞克隆的免疫細(xì)胞組成與腫瘤比例有顯著差異，腫瘤純度與腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的趨勢相反。最近報道了高腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）對晚期癌癥治療效果的影響。DSP的創(chuàng)新應(yīng)用為通過整合基質(zhì)區(qū)域的遺傳信息來改善雙特異性抗體治療的治療結(jié)果預(yù)測提供了令人信服的證據(jù)。

3.3.3 肺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移

癌癥的發(fā)展涉及腫瘤細(xì)胞對環(huán)境的適應(yīng)，是生命的必然和持續(xù)的結(jié)果。到目前為止，追蹤人類癌癥的進(jìn)化主要集中在DNA突變上。然而，基因型不一定是表型，腫瘤內(nèi)的癌癥細(xì)胞群通常表現(xiàn)出顯著差異和轉(zhuǎn)錄多樣性。在這一方面，肺癌表現(xiàn)出更復(fù)雜的分子和形態(tài)學(xué)異質(zhì)性以及亞克隆突變的不同組合，降低了癌癥研究的可重復(fù)性，并對有效治療提出了挑戰(zhàn)。Zhu等人整合RNA-seq和ST技術(shù)，構(gòu)建了LUAD的單細(xì)胞時空多組學(xué)圖譜，以探索早期LUAD的動態(tài)進(jìn)化軌跡。結(jié)果表明，LUAD可能起源于Clara和AT2細(xì)胞，最終進(jìn)化為UBE2C 癌癥細(xì)胞亞群，其中UBE2C介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。隨著LUAD從原位腺癌（AIS）發(fā)展為侵襲性腺癌（IAC），癌癥細(xì)胞的空間分布可能比其類型更重要。這一發(fā)現(xiàn)彌補了scRNA-seq免疫分型LUAD缺乏空間信息的缺陷。此外，研究已經(jīng)報道了基于DSP的NSCLC腦轉(zhuǎn)移（BrMs）的機(jī)制。與原發(fā)性腫瘤相比，這些發(fā)現(xiàn)突出了與BrMs病變相關(guān)的高度免疫抑制微環(huán)境，其特征是B細(xì)胞和T細(xì)胞豐度降低，中性粒細(xì)胞浸潤增加，為癌癥BMS的空間異質(zhì)性提供了一個框架，并確定了轉(zhuǎn)移的特征基因以預(yù)測患者的預(yù)后。

3.3.4 瘤內(nèi)微生物群

肺癌具有獨特的微生物組成。幾項研究表明，腫瘤中的細(xì)菌種群是腫瘤類型特異性的，可能直接調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。Wong-Rolle等人從12名癌癥患者中獲得了空間宏轉(zhuǎn)錄組信息，以了解肺癌中微生物群的空間分布及其對宿主細(xì)胞異質(zhì)性的影響，結(jié)果顯示細(xì)菌顯著集中在腫瘤細(xì)胞中，從正常組織和第三淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）到腫瘤細(xì)胞的含量增加，并在氣道中達(dá)到峰值，表明癌癥中的細(xì)菌可能來源于氣道而不是腸道菌群。進(jìn)一步的基因表達(dá)相關(guān)性分析顯示，細(xì)菌含量與CTNNB、HIF1A和VEGFA基因呈正相關(guān)。此外，與腫瘤發(fā)生相關(guān)的幾種信號通路也與癌癥中的細(xì)菌含量呈正相關(guān)。作者相信空間轉(zhuǎn)錄組和局部相互作用組分析可以預(yù)測個體腫瘤行為，并為了解和逆轉(zhuǎn)癌癥進(jìn)展提供有用的資源。

3.4 肺纖維化

肺纖維化是一種高度異質(zhì)性的肺部終末期病理變化，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。首次發(fā)表的使用ST的肺纖維化研究聚焦于上皮細(xì)胞，證明了典型間質(zhì)性肺炎/特發(fā)性肺纖維化（IPF）患者的上皮細(xì)胞/成纖維細(xì)胞病灶三明治樣的獨特分子特征。IPF的發(fā)病機(jī)制與上皮功能障礙有關(guān)。另一項研究使用GeoMx DSP平臺來探索IPF病例中成纖維細(xì)胞灶與纖維和正常區(qū)域之間的轉(zhuǎn)錄差異，并確定了在成纖維細(xì)胞病灶中表達(dá)的新的成纖維生物標(biāo)志物。時空分析為肺纖維化的研究發(fā)展帶來了希望。例如，Shi等人探討了二氧化硅吸入引起的繼發(fā)性肺纖維化進(jìn)展中異質(zhì)性成纖維細(xì)胞的時空分布。結(jié)果表明，GREM1作為引起炎癥的驅(qū)動因素，參與了這種肺部疾病的變化，可能是矽肺早期治療的潛在靶點。

3.5 肺炎

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV2）引發(fā)的2019冠狀病毒（新冠肺炎）大流行已在全球范圍內(nèi)造成數(shù)百萬例嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此應(yīng)更好地確定宿主對其感染的反應(yīng)。ST為識別嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型感染后的細(xì)胞類型和闡明異質(zhì)性提供了新的見解，如表1所示。布羅德研究所與哈佛醫(yī)學(xué)院和其他機(jī)構(gòu)合作，創(chuàng)建了感染后肺部空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了肺上皮、免疫和間質(zhì)室的重塑，并繪制了與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的細(xì)胞類型和基因。對COVID-19感染患者的分析強調(diào)了導(dǎo)致患者死亡的疾病的兩個階段。Desai等人表明，RNA水平與疾病持續(xù)時間有關(guān)，報告了病毒載量和免疫反應(yīng)的顯著時空異質(zhì)性。據(jù)估計，新冠肺炎感染將導(dǎo)致各種并發(fā)癥和嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型（PASC）急性后遺癥。Dinnon等構(gòu)建小鼠模型，利用RNA-ISH和GeoMx DSP鑒定急慢性疾病分期的轉(zhuǎn)錄譜，為“長COVID”的檢測和改進(jìn)提供策略。此外，從SARS-CoV2和H1N1誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）患者的肺組織中獲得的DSP數(shù)據(jù)顯示出獨特的轉(zhuǎn)錄特征，從而確定了新的治療靶點。

表1.利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究新冠肺炎的機(jī)制和并發(fā)癥。

3.6 其他呼吸道疾病

原位測序和捕獲技術(shù)已應(yīng)用于結(jié)核病和流感感染的機(jī)制研究和治療靶點發(fā)現(xiàn)。例如，有研究以感染H1N1的小鼠為模型研究ARDS，發(fā)現(xiàn)過度激活的成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)重塑酶，從而促進(jìn)免疫細(xì)胞的浸潤，導(dǎo)致肺功能受損。許多研究使用scRNA-seq評估了其他呼吸系統(tǒng)疾病，如肺動脈高壓、哮喘和慢性阻塞性肺疾?。–OPD）。空間組學(xué)技術(shù)的引入有望加深對呼吸系統(tǒng)疾病的認(rèn)識。

4 挑戰(zhàn)與展望

盡管ST和相關(guān)的前沿生物信息學(xué)分析徹底改變了復(fù)雜器官和組織的研究，為發(fā)展系統(tǒng)和疾病機(jī)制帶來了巨大的希望，但要發(fā)揮其潛力，還需要解決幾個挑戰(zhàn)（圖4）。

圖4.空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）的挑戰(zhàn)和前景。ST向高通量、全長轉(zhuǎn)錄組、活細(xì)胞體內(nèi)分析方向發(fā)展，并將多組學(xué)和時空組學(xué)相結(jié)合，借助樣品處理和生物信息學(xué)工具構(gòu)建三維空間圖譜，為探究組織結(jié)構(gòu)和功能提供強大的新技術(shù)。

4.1 樣本的準(zhǔn)備和處理

預(yù)測序樣本的穩(wěn)定性和可用性可能是限制ST的主要障礙。任何含有mRNA的完整組織都適合空間轉(zhuǎn)錄組；然而，樣品制備方案應(yīng)根據(jù)不同組織的特點進(jìn)一步優(yōu)化。還應(yīng)考慮組織類型之間的形態(tài)學(xué)差異。例如，單細(xì)胞/組織斑點會顯著影響轉(zhuǎn)錄水平，皮膚細(xì)胞樣本中的色素沉積會因光吸收而對圖像采集產(chǎn)生負(fù)面影響。同樣，具有肺泡囊的肺組織在冷凍時必須小心處理。此外，樣本收集、儲存和處理方法與原始轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)存在測量偏差。一項研究探索了發(fā)育中的人類心臟的時空基因表達(dá)圖譜。將心臟組織切碎，并使用胰蛋白酶和膠原酶在懸浮液中培養(yǎng)以產(chǎn)生單個細(xì)胞。一些研究應(yīng)用外源性試劑進(jìn)行分離；然而，他們幾乎沒有提到基于物理化學(xué)的分離和非自然處理是否會影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平，從而降低生成的scRNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性。關(guān)于空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，基于原位捕獲和測序的策略已經(jīng)實現(xiàn)了無組織解剖測序，顯著降低了樣品制備的風(fēng)險。然而，組織切片制備對轉(zhuǎn)錄組的影響也應(yīng)從宏觀角度考慮。因此，在樣品制備方面需要進(jìn)一步創(chuàng)新。理想情況下，用于測序的組織切片的上游處理是自動化的，使非專業(yè)人員可以操作。

越來越多的證據(jù)表明，ST可能有助于臨床診斷、了解人類疾病和做出正確的藥物決策。福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織塊是臨床診斷中人體組織保存方法的金標(biāo)準(zhǔn)。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的快速發(fā)展與FFPE塊兼容，這是對樣本庫中超過10億個FFPE切片進(jìn)行深入病理分析的突破。不幸的是，樣本中的RNA分子經(jīng)常被嚴(yán)重降解；因此，迫切需要一個能夠分析FFPE樣本的平臺。10×Genomics Visium和NanoString DSP已證明其與FFPE塊的兼容性。Visium Cytasist于2022年底推出，由10×Genomics能夠在30分鐘內(nèi)對組織切片進(jìn)行自動轉(zhuǎn)移分析，同時對一個FFPE樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)分析。然而，由于FFPE組織塊通常儲存在固定溶液中，并且從活檢到固定的時間可能因樣本而異，因此RNA的完整性也遠(yuǎn)低于新鮮冷凍組織。此外，由于數(shù)據(jù)的質(zhì)量可能取決于特定樣本，因此在臨床應(yīng)用之前，應(yīng)提高其可靠性和穩(wěn)健性。

4.2 高通量全長轉(zhuǎn)錄組

ST解決了scRNA-seq方法中由于細(xì)胞解離而丟失空間位置信息的問題。然而，除了空間尋址，這些方法的轉(zhuǎn)錄覆蓋率和深度仍處于早期發(fā)展階段。大多數(shù)ST方法只能檢索單端轉(zhuǎn)錄物，而不能檢索全長轉(zhuǎn)錄物。尚未檢測到多聚腺苷化RNA分子的殘差序列和非多聚腺苷化轉(zhuǎn)錄本的譜，這阻礙了免疫細(xì)胞受體譜和選擇性剪接（AS）的研究。基于顯微解剖的方法表現(xiàn)出理想的覆蓋范圍，但轉(zhuǎn)錄的通量和空間分辨率不理想，需要在組織切片的覆蓋范圍和轉(zhuǎn)錄本的檢測靈敏度之間進(jìn)行權(quán)衡。基于ISH的方法具有良好的空間分辨率和檢測效率；然而，它們難以用于大組織切片和高通量。ISS具有高分辨率，但犧牲了轉(zhuǎn)錄捕獲深度。最近，一種利用加A尾對單細(xì)胞進(jìn)行大量轉(zhuǎn)錄組分析的方法被提出，即VASA-seq，這是目前唯一一種集高靈敏度、全長轉(zhuǎn)錄組覆蓋和高通量于一體的單細(xì)胞測序技術(shù)。然而，VASA-seq無法獲得細(xì)胞的空間位置信息。此外，高通量微流體與條形碼索引的結(jié)合雖然提高了通量，但由于細(xì)胞固定和通透性處理，RNA的質(zhì)量可能會下降。此外，還需要提高細(xì)胞/球的共包封效率。因此，更高的基因覆蓋率、更低的檢測偏差和更高的空間分辨率直至單細(xì)胞水平的技術(shù)備受期待。

4.3 3D空間圖譜

目前，大多數(shù)先進(jìn)的空間技術(shù)僅限于在2D模式上顯示細(xì)胞組織和基因表達(dá)，而不是在實際的3D空間圖譜上顯示，這無法概括高度復(fù)雜的空間細(xì)胞環(huán)境。Tomo-seq在不同的組織切片上進(jìn)行RNA-seq，以獲得空間信息。類似地，Geo-seq與LCM技術(shù)相結(jié)合，研究具有空間位置的小樣本的轉(zhuǎn)錄組。Peng等人用它構(gòu)建了小鼠胚胎的3D轉(zhuǎn)錄組圖譜，并準(zhǔn)確地將單個外胚層細(xì)胞定位回其體內(nèi)位置。然而，Geo-seq操作很復(fù)雜，需要連續(xù)的組織切片、LCM技術(shù)和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的測序過程。最近，NanoString的GeoMx DSP和STRP-seq已被開發(fā)用于結(jié)合生物信息學(xué)工具來重建3D結(jié)構(gòu)圖，如小鼠大腦和人類心臟。然而，這些技術(shù)受到空間分辨率和大樣本量的限制。作者相信，高精度的3D結(jié)構(gòu)重建和表征將進(jìn)一步為臨床應(yīng)用和研究提供堅實的基礎(chǔ)。

4.4 體內(nèi)活細(xì)胞/組織

目前的ST方法不能應(yīng)用于活細(xì)胞的體內(nèi)組織學(xué)研究，因為它們只研究固定樣本中某個時間的細(xì)胞快照。觀察到的基因表達(dá)譜可能只是表達(dá)異質(zhì)性的產(chǎn)物。這些技術(shù)將細(xì)胞限制在單個時間點的活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，而其他具有類似功能的細(xì)胞可能處于休眠狀態(tài)。因此，他們在個體基因水平和時間尺度上正確推斷細(xì)胞的能力仍然存在爭議。一些研究小組試圖在體外研究活細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。例如，TIVA率先在活細(xì)胞中捕獲mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析。然而，這種方法目前不適用于許多細(xì)胞的分析。ZipSeq使用光籠寡核苷酸和特異性圖案化照明在完整組織的活細(xì)胞上標(biāo)記DNA編碼（Zipcode），以探索其空間異質(zhì)性。然而，它的低空間分辨率限制了它的應(yīng)用范圍。同樣，Live-seq是第一個實現(xiàn)對活細(xì)胞中全基因表達(dá)的連續(xù)觀察。然而，仍然存在一些問題，如在體內(nèi)不適用和多次采樣的局限性。因此，下一步的研究方向是如何推斷未來或?qū)⑦^去的事件與當(dāng)前的基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)，實現(xiàn)對活體細(xì)胞或組織中空間組學(xué)的探索，并在最小的細(xì)胞干擾下實時跟蹤mRNA動態(tài)。

4.5 空間多組學(xué)和時空組學(xué)

ST在多組學(xué)數(shù)據(jù)和單細(xì)胞分辨率方面進(jìn)展迅速。這一進(jìn)展使得能夠在單個實驗裝置內(nèi)檢索包括剪接變異、遺傳和表觀遺傳學(xué)變化、蛋白質(zhì)組學(xué)和時間維度數(shù)據(jù)在內(nèi)的綜合信息。這將有助于理解細(xì)胞-細(xì)胞相互作用和整體細(xì)胞表型/狀態(tài)，以從多個空間尺度解決組織功能。如前所述，獲得更全面的多組學(xué)圖譜的最穩(wěn)健策略是處理連續(xù)的組織切片，其中每個切片都由不同的組學(xué)分析。然而，連續(xù)的組織切片采樣可能會導(dǎo)致樣本異質(zhì)性偏差。

研究人員在開發(fā)各種單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)方面取得了顯著進(jìn)展，如表2所示。此外，針對人類單細(xì)胞組學(xué)，已經(jīng)專門設(shè)計了多個數(shù)據(jù)庫，為數(shù)據(jù)分析和解釋提供了全面的分析工具。在此基礎(chǔ)上，空間多組學(xué)技術(shù)得到了發(fā)展，包括多組學(xué)單掃描綜合組合分析（MOSAICA）、SM-omics、空間分子成像（SMI）、DBiT-seq和空間蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄組測序（SPOTS），這些技術(shù)保留了空間信息坐標(biāo)。開發(fā)新技術(shù)，如mIHC和飛行時間細(xì)胞術(shù)（CyTOF），也促進(jìn)了與ST的聯(lián)合分析。目前，空間多組學(xué)已列入《自然》雜志2022年的年度技術(shù)名單。盡管如此，空間多組學(xué)測序仍處于初級階段。剪接變異體傳統(tǒng)上很難在RNA水平上檢測到，因為大多數(shù)技術(shù)都是基于單端轉(zhuǎn)錄分析。在蛋白質(zhì)水平上，對靶向蛋白質(zhì)的分析受到可用變體（如熒光染料、條形碼或抗體）數(shù)量的限制，并且僅限于對靶向蛋白的分析。此外，組蛋白修飾、染色質(zhì)可及性和代謝組學(xué)研究仍然缺乏空間對應(yīng)物。綜合方法需要高質(zhì)量地獲取多個參數(shù)，如基因覆蓋率、通量、準(zhǔn)確性和測序深度。最后，還應(yīng)考慮如何實現(xiàn)實際的單細(xì)胞分辨率。

表2.單細(xì)胞多組學(xué)分析。

另一方面，生物系統(tǒng)中的基因表達(dá)是高度動態(tài)的，從時間和空間維度分析細(xì)胞相互作用和調(diào)節(jié)機(jī)制有助于理解復(fù)雜系統(tǒng)中的規(guī)則，即時空組學(xué)。在RNA-seq中引入RNA代謝標(biāo)記策略，以區(qū)分新的mRNA和舊的mRNA，如4-硫代吡啶（4sU）和5-乙炔基尿苷（5-EU）。此外，RNA時間戳與RNA-seq結(jié)合，以小時為單位推斷RNA的“年齡”。然而，這些方法僅適用于描述細(xì)胞的短時間尺度或時間點特征。因此，對同一細(xì)胞的連續(xù)分析和空間定位使時空組學(xué)成為可能，如“高通量Patch-seq”和“具有空間信息的Live-seq”。

4.6 生物信息學(xué)支持

在數(shù)據(jù)分析階段，空間維度、數(shù)據(jù)量和復(fù)雜性的增加帶來了巨大的挑戰(zhàn)。用于scRNA-seq分析的許多生物信息學(xué)工具可以很容易地用于空間分析，包括去卷積、聚類、細(xì)胞類型注釋和其他必要的處理步驟。然而，它忽略了空間位置和結(jié)構(gòu)特征；因此，必須對現(xiàn)有的生物信息學(xué)計算管道進(jìn)行改進(jìn)，以分析ST的獨特特性。Trendseek、SpatialDE、基于圖拉普拉斯算子的綜合單細(xì)胞空間分析（GLISS）和SpaGCN已被開發(fā)用于分析空間位置和基因表達(dá)之間的關(guān)系。研究細(xì)胞之間相互作用的方法包括基因圖形卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（GCNG）、空間方差分量分析（SVCA）、novaSpaRc和SpaOTsc。空間聚類使用stLearn、BayesSpace、使用基于經(jīng)驗貝葉斯的隱馬爾可夫隨機(jī)場的空間聚類（SC-MEB）和MULTILAYER等方法。預(yù)計空間組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步將導(dǎo)致分析計算工具的激增，促進(jìn)不同平臺之間的數(shù)據(jù)協(xié)調(diào)，并促進(jìn)機(jī)器學(xué)習(xí)和圖像分割等信息工具的整合。這種整合對于更深入地理解復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)和將可用性擴(kuò)展到廣泛的可用數(shù)據(jù)源至關(guān)重要。

除了10×Visium,Stereo-seq和GeoMx DSP等商業(yè)平臺外，上述大多數(shù)ST技術(shù)通常僅限于實驗室?？紤]到最近這些方法的發(fā)表以及將實驗轉(zhuǎn)化為診斷應(yīng)用的高成本，這種限制是可以預(yù)料到的。標(biāo)準(zhǔn)化實驗程序和數(shù)據(jù)分析管道有望促進(jìn)空間組學(xué)分析技術(shù)的商業(yè)化和廣泛可及性。此外，整合自動化樣品處理、3D結(jié)構(gòu)、深度切片掃描和時間數(shù)據(jù)的工作將通過揭示新的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和擴(kuò)大人們對生物過程的理解進(jìn)一步推進(jìn)這一領(lǐng)域。鑒于ST的未來發(fā)展需要多學(xué)科的融合，生物信息學(xué)分析、自動化設(shè)備、臨床轉(zhuǎn)化研究和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究人員之間的密切合作勢在必行。

結(jié)論

本篇綜述介紹了ST的前沿技術(shù)及其在器官/組織生理和病理過程中的應(yīng)用。作為scRNA-seq的新迭代，ST的領(lǐng)域正在迅速擴(kuò)展，顯著提高了人們對發(fā)育生物學(xué)和發(fā)病機(jī)制的理解，并改變了診斷、理解和治療疾病的能力。隨著生物信息學(xué)、工程和SM組學(xué)的全面合作，作者希望在成本顯著降低時獲得有關(guān)全長轉(zhuǎn)錄組的高通量分子信息。這些數(shù)據(jù)將為闡明組織生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制之間的相互作用提供更全面的視角。