王鄧, 孫航, 吳傳新

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

肝臟在各種致病因素持續(xù)損傷下反復(fù)發(fā)生纖維化，正常的肝組織被瘢痕和再生結(jié)節(jié)所取代，最終形成肝硬化。肝硬化也是慢性肝病的常見終末期表現(xiàn)，2012年全球致死病因排名中，肝硬化排第14位。肝移植被認(rèn)為是肝硬化最有效的治療方案，但因供體不足、經(jīng)費較高、免疫排斥等原因，大多數(shù)肝硬化患者并未進行肝移植。

近年來多項研究報道了自體骨髓干細(xì)胞（BMSC）參與了肝功能的修復(fù)和重建，但具體機制并不清楚。自體BMSC抗纖維化作用已在動物模型中得到明確證實。此外，臨床試驗也表明自體BMSC移植能迅速改善肝功能，且無明顯副作用。但目前開展的自體BMSC治療肝硬化的臨床試驗并不多，也沒有統(tǒng)一的治療方案。因此本文將從自體BMSC治療肝硬化的機制、BMSC輸入通路、療效評估指標(biāo)、細(xì)胞輸入劑量等方面進行綜述。

1 BMSC治療肝硬化機制

BMSC治療肝硬化的機制目前認(rèn)為主要有兩種：一是功能性肝細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化，二是通過旁分泌改善微環(huán)境。

1.1 功能性肝細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化

BMSC進入肝實質(zhì)后，在微環(huán)境的刺激下一方面可分化為肝臟卵圓細(xì)胞，另一方面可直接分化為肝實質(zhì)細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞。肝臟卵圓細(xì)胞是Farber在研究肝癌的病理變化時所發(fā)現(xiàn)，因細(xì)胞呈卵圓形而被命名為卵圓細(xì)胞。成年人肝臟中卵圓細(xì)胞極少，主要分布在門靜脈周圍，處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝臟受到致病因素刺激時，本身存在的肝臟卵圓細(xì)胞和新分化生成的卵圓細(xì)胞因微環(huán)境發(fā)生改變和細(xì)胞因子的刺激，可分化為肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞等。Goff等發(fā)現(xiàn)BMSC可分化成肝卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞，并且這些由BMSC分化而來的卵圓細(xì)胞表面表達了造血干細(xì)胞的CD34、Thy-1等標(biāo)志。Oh等在動物實驗中發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子可誘導(dǎo)大鼠骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。Lange等發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在聯(lián)合應(yīng)用肝細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子及表皮生長因子后可轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。Aziz等將大鼠BMSC經(jīng)尾靜脈注入肝纖維化大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BMSC在大鼠體內(nèi)可分化為肝樣細(xì)胞，且大鼠肝纖維化得到明顯改善。

1.2 旁分泌作用

BMSC進入肝臟后，不論是發(fā)生細(xì)胞分化還是發(fā)揮抗肝纖維化作用，都離不開各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的參與。這些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)可激活肝祖細(xì)胞，從而抑制星狀細(xì)胞激活并促進其凋亡，抑制損傷部位炎癥的相關(guān)細(xì)胞增殖和遷移等。目前發(fā)現(xiàn)參與旁分泌作用的因子主要有肝細(xì)胞生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、IL-10等。每種細(xì)胞因子和介質(zhì)的作用各不相同，彼此之間相互協(xié)調(diào)，共同參與抗纖維化作用。比如肝細(xì)胞生長因子有保護肝細(xì)胞、促進肝細(xì)胞再生、加速肝功能恢復(fù)等作用。基質(zhì)金屬蛋白酶則主要參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解。有動物實驗報道提高基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達可增加細(xì)胞外基質(zhì)的降解，改善小鼠肝功能并減輕肝纖維化。Sun等將體外培養(yǎng)的BMSC注入肝纖維化小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠肝纖維化明顯改善，且小鼠體內(nèi)IL-10表達明顯升高。

2 BMSC輸入通道

臨床上BMSC治療肝硬化時，細(xì)胞輸入通道主要包括肝動脈、門靜脈、外周靜脈、肝內(nèi)或脾內(nèi)注射。

2.1 肝動脈

肝動脈分為左右兩支，血液從腹腔干經(jīng)肝動脈直接進入肝內(nèi)。臨床上肝動脈由于其重要的解剖原因，主要用于肝臟腫瘤介入治療的通路。在自體BMSC治療肝硬化中，肝動脈也可作為細(xì)胞注入的通路。Walczak等研究表明肝動脈輸注有助于BMSC的歸巢，靜脈注射BMSC后，BMSC首先進入肺部，然后進入肝臟。在這個過程中干細(xì)胞可能被毛細(xì)血管組織中的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬。在動物實驗中，外周注射干細(xì)胞后，干細(xì)胞成像信號會隨著時間的推移而減弱。Zhao等的一項關(guān)于干細(xì)胞治療肝病的薈萃分析結(jié)果顯示，經(jīng)肝動脈輸注干細(xì)胞更利于患者肝功能的改善。Laio等在應(yīng)用BMSC治療肝硬化的臨床試驗中，選擇經(jīng)肝動脈輸注干細(xì)胞，結(jié)果顯示干細(xì)胞治療組的患者在治療后12周血清Alb、TBil等多項指標(biāo)得到明顯改善。

2.2 門靜脈

門靜脈是肝門重要的脈管結(jié)構(gòu)，胃腸道血液回流至腸系膜上靜脈后匯入門靜脈內(nèi)。在超聲引導(dǎo)下穿刺門靜脈，可直接注入干細(xì)胞，而且避開了肺部循環(huán)。Salama等在研究中對90例肝硬化患者進行超聲引導(dǎo)下經(jīng)門靜脈注入干細(xì)胞，術(shù)后患者未發(fā)生肝門部膽管損傷、出血等并發(fā)癥。試驗結(jié)果表明門靜脈輸注BMSC后能明顯改善肝硬化患肝功能。但由于肝硬化患者靜脈血流阻力增高，疾病晚期常伴有門靜脈高壓，若直接穿刺門靜脈需考慮出血風(fēng)險。

2.3 外周靜脈

外周靜脈是臨床治療時應(yīng)用最為廣泛的輸注通道，其操作簡單方便，普通病房即可完成，且并發(fā)癥少。因此外周靜脈也可以作為BMSC輸注通路之一。同肝動脈輸注相比，外周靜脈需要先經(jīng)過肺部循環(huán)，因此療效受到一定的削減。Mohamadnejad等的一項自體BMSC治療肝硬化的隨機對照研究中，試驗組患者均通過肘部靜脈輸注自體BMSC，結(jié)果表明經(jīng)外周靜脈輸注BMSC后可以一定程度改善患者肝功能。

2.4 肝內(nèi)或脾內(nèi)注射

除了上述通路外，也有學(xué)者提出將干細(xì)胞直接注入肝臟或脾臟內(nèi)。國內(nèi)外已有動物實驗表明直接經(jīng)脾臟或肝臟注射干細(xì)胞可以改善肝功能。黃增輝等將肝干細(xì)胞直接注入急性肝損傷的小鼠脾臟內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠肝損傷得到明顯改善。張麗霞等將BMSC注入肝硬化小鼠的脾臟內(nèi)，移植4周后小鼠肝臟病理切片顯示硬化程度減輕，膠原纖維及壞死面積減少，組織結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)。Amer等在一項40人參與的病例對照研究中，試驗組20人予以BMSC治療，其中10人經(jīng)脾臟內(nèi)注射干細(xì)胞，其余10人則行肝內(nèi)注射。結(jié)果顯示經(jīng)兩種途徑治療后，肝硬化患者Alb和終末期肝病模型（MELD）評分得到了明顯改善。作者指出兩種途徑在療效上并無差異，但經(jīng)脾臟注射操作更加方便。

3 BMSC輸入劑量

自體BMSC治療肝硬化的有效性已得到臨床試驗的證實，但關(guān)于治療時干細(xì)胞輸注劑量沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外臨床試驗在輸入劑量選擇上也沒有明確提出理論依據(jù)。目前開展的自體BMSC治療肝硬化的臨床試驗中使用的干細(xì)胞輸注劑量大致呈三個梯度，分別是BMSC≤5×10^7、5×10^7＜BMSC≤ 4×108和BMSC＞4×10^8。Suk等在一項BMSC治療肝硬化的臨床隨機對照研究中，選擇經(jīng)肝動脈輸注5×10^7個BMSC，結(jié)果顯示患者ALT、AST、TBil、Alb治療前后改善程度在試驗組和對照組間無明顯差異。Salama等在BMSC治療肝硬化時，向患者輸注5×10^7個BMSC，治療前后患者Alb、ALT、AST、TBil得到明顯改善。Amer等向肝硬化患者肝內(nèi)或皮內(nèi)直接注射2×10^8個BMSC，治療后隨訪顯示肝硬化患者治療前后Alb和MELD評分得到了明顯改善。Laio等在進行自體BMSC治療肝硬化的研究時，經(jīng)肝動脈注入（9.08±1.77）×10^8個BMSC，結(jié)果顯示干細(xì)胞治療后患者ALT、AST、TBil、Alb得到了明顯改善。吳玉卓等在應(yīng)用自體BMSC治療乙型肝炎失代償期肝硬化患者時，經(jīng)肝動脈向患者肝內(nèi)注入（1~11）×10^8個BMSC，經(jīng)過24周隨訪發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療后患者ALT、AST、TBil得到明顯改善，并且患者的1年生存率得到提高。

4 療效評估指標(biāo)

對于干細(xì)胞治療肝硬化療效評估，需要多項指標(biāo)綜合判斷，其中以肝功能和凝血功能相關(guān)指標(biāo)應(yīng)用最為廣泛。肝功能指標(biāo)主要包括ALT、AST、TBil、Alb、MELD評分、Child-Pugh評分等。凝血功能指標(biāo)主要包括凝血酶原活動度(PTA)、凝血酶原濃度（PC）、凝血酶原時間（PT）和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）。由于肝硬化的本質(zhì)就是肝臟反復(fù)纖維化的結(jié)果，因此不論是代表肝臟合成功能的Alb，還是體現(xiàn)肝細(xì)胞受損程度的AST和ALT，都可直接評估治療效果。另外肝臟是人體內(nèi)凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ等合成的主要場所，因此凝血功能的變化可間接評估治療效果。Salama等在BMSC治療后隨訪中觀察了肝硬化患者Alb、ALT、AST、TBil、PC的變化，結(jié)果表明在治療后第12周，所有指標(biāo)均得到明顯改善。Suk等一項關(guān)于干細(xì)胞治療肝病的研究表明INR治療前后的變化在干細(xì)胞治療組和對照組之間無明顯差異。

除上述指標(biāo)外，臨床上也有學(xué)者選擇肝纖譜、肝臟體積、脾臟體積、肝臟儲備功能、血常規(guī)、功能狀態(tài)評分、疲勞量表、炎癥因子等作為評估指標(biāo)。Mohamadnejad等在BMSC治療肝硬化后的第48周通過CT測量并統(tǒng)計干細(xì)胞治療組和對照組患者肝臟體積的變化，發(fā)現(xiàn)兩組之間無明顯差異。Amer等在研究中向終末期肝病患者輸注骨髓來源的肝樣細(xì)胞，治療后8周隨訪發(fā)現(xiàn)，經(jīng)干細(xì)胞治療的肝病患者MELD評分、Child-Pugh評分、功能狀態(tài)評分和疲勞量表得到明顯改善。吳玉卓等發(fā)現(xiàn)BMSC治療可明顯改善患者Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原蛋白。Bai等在自體BMSC治療肝硬化的病例對照研究中隨訪了患者白細(xì)胞、血紅蛋白和血小板的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在治療后的第24周，干細(xì)胞治療組的白細(xì)胞、血紅蛋白和血小板得到明顯改善。黃麗雯等對31例終末期肝病患者進行干細(xì)胞治療的隨機對照試驗，患者在治療前及治療后12周分別行吲哚菁綠清除試驗評估肝臟儲備功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療后患者的肝臟儲備功能得到明顯改善。Xu等研究發(fā)現(xiàn)BMSC治療后的肝硬化患者血清中IL-6和IL-7明顯低于對照組患者。

5 其他

5.1 BMSC動員

粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）是由174個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。G-CSF是目前應(yīng)用最多的干細(xì)胞動員劑?；A(chǔ)研究表明皮下注射G-CSF一方面能夠動員BMSC，使BMSC與基質(zhì)細(xì)胞的黏附作用被打破，利于BMSC的純化和收集；另一方面G-CSF可促進大量干細(xì)胞入血，增加了干細(xì)胞的療效。Liu等進行了一項BMSC治療失代償肝硬化的臨床研究，在患者進行干細(xì)胞移植前予以皮下注射G-CSF，治療后第4周隨訪顯示得到改善的指標(biāo)包括ALT、AST、Alb、TBil、PT。

G-CSF皮下注射在增加BMSC濃度的同時，同樣可誘發(fā)外周血白細(xì)胞異常升高，發(fā)生“類白血病”反應(yīng)。肝硬化患者本身大多存在凝血障礙、肝功能異常、脾功能亢進等，皮下注射G-CSF可能導(dǎo)致患者臨床癥狀加重，甚至發(fā)生休克、脾破裂等嚴(yán)重并發(fā)癥。王迪等對51例失代償期肝硬化患者連續(xù)2 d給予G-CSF動員BMSC，注射劑量為4 μg·kg-1·d-1。連續(xù)監(jiān)測患者外周血常規(guī)，發(fā)現(xiàn)患者白細(xì)胞明顯升高，最高達正常值4.5倍，部分患者出現(xiàn)輕微腹痛、發(fā)熱，但沒有患者發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥。

5.2 BMSC提取

目前BMSC提取方式主要是通過骨髓穿刺，抽出的BMSC通過體外培養(yǎng)擴增再進行移植。臨床上3個主要穿刺部位分別是髂前上棘、髂后上棘和胸骨。胸骨因其后為大血管，穿刺風(fēng)險較高而不常用。髂前上棘骨皮質(zhì)較厚，骨面不平整，骨質(zhì)較硬，進針困難，且髂前上棘毗鄰腹腔，若穿刺針滑脫易穿入腹腔，導(dǎo)致腹腔感染或腸道穿孔等。Peng等在一項病例對照研究中選擇髂前上棘行骨髓穿刺，所有穿刺患者術(shù)后未發(fā)生腹腔臟器損傷及感染。髂后上棘骨面較平，進針較容易，不與重要臟器緊鄰，該處穿刺創(chuàng)傷小、易愈合。Bai等、Xu等在自體BMSC治療肝病的臨床試驗中，均選擇髂后上棘作為穿刺部位，患者穿刺術(shù)后僅出現(xiàn)穿刺點疼痛，無其余并發(fā)癥，予以對癥處理后均好轉(zhuǎn)。

BMSC通常通過直接骨穿刺獲得，但值得注意的是，外周循環(huán)血細(xì)胞篩選也可以獲得骨髓干細(xì)胞。Tayeb等對肝硬化患者行G-CSF干細(xì)胞動員后，直接通過外周血行干細(xì)胞分離和收集，將收集的細(xì)胞進行擴增并進行干細(xì)胞治療。

6 總結(jié)及展望

自體BMSC在治療肝硬化上取得了一定成果。同臍帶干細(xì)胞、肝干細(xì)胞相比，自體BMSC方便獲取、體外易培養(yǎng)擴增、無免疫排斥，可作為肝移植的替代療法。但在臨床實際應(yīng)用BMSC時仍存在許多問題，如：（1）BMSC治療肝硬化的機制涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，目前具體機制并不清楚；（2）對于治療中BMSC輸注的劑量問題，并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；（3）自體BMSC作為肝移植的替代療法，部分患者移植干細(xì)胞后癥狀和評估指標(biāo)得以改善，但對于BMSC療效持續(xù)時間目前并不清楚；（4）BMSC對肝硬化的療效已得到證實，但對BMSC二次或者多次治療的時間問題上缺乏相關(guān)研究報道；（5）臨床研究中不論肝硬化患者是否接受干細(xì)胞動員，采集的干細(xì)胞均可在體外培養(yǎng)擴增，并且接受動員劑的同時有可能誘發(fā)其他并發(fā)癥，因此自體骨髓干細(xì)胞提取前是否需要予以干細(xì)胞動員仍需討論；（6）雖然自體BMSC移植在眾多臨床研究中沒報道過嚴(yán)重并發(fā)癥，但干細(xì)胞本身具備分化功能，在肝硬化患者復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境中，其有可能發(fā)生異常增生，甚至發(fā)生惡變。總體來說，自體BMSC移植治療肝硬化目前并沒有統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的治療方案。但對于無法得到肝移植的晚期肝硬化患者而言，自體BMSC移植是不錯的替代療法。

引證本文：王鄧, 孫航, 吳傳新. 自體骨髓干細(xì)胞治療肝硬化的應(yīng)用及管理[J]. 臨床肝膽病雜志, 2019, 35(4): 895-898.

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本文編輯：朱晶

微信編輯：邢翔宇